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etc.温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, 简称ITC)is近年来发展起来of一种research生物热力学with生物动力学ofimportant方法, 它through高Sensitivity, 高自动化of微量量热仪连续, accurate地监测andrecord一pcs变化过程of量热曲线, 原位, in线and无损伤地同时provide热力学and动力学信息.
ITCinstrument包含参比池and样品池, 其中参比池中加入稀释溶液作forcontrol, 彼此through绝热装置隔开. in恒温条件下, 注射器中of药物溶液滴定到含have目ofproteinof样品池中, 两种物质相互作用, 释放或吸收of热量with结合量成正比, ITC工作原理such as下图所示. 当样品池中ofprotein溶液被药物分子饱and时, 热量信号逐渐减弱, most后只能observe到滴定of背景溶液热量.
simple地说, 就is指将一种反应物配制成澄清溶液放in一pcs温控样品池中, through一pcs热电偶回路with参比池偶联, 另一种反应物作for配体置于注射器中. 其中, 样品池and参比池through绝热装置隔开, 但保持环境条件相同. in恒定温度下, 注射器以一定速度向样品池中不断滴加配体, 注射器还具have搅拌功能, 反应一定时间, instrument测量样品池of热量变化并使其with参比池平衡, 显示for一pcs吸热或放热of峰. 放热反应触发恒温功率of负反馈, 而吸热反应则触发恒温功率of正反馈来保持温度恒定.
1, be able toin单pcs实验中确定多pcs热力学结合参数 (即化学计量, 缔合常数and结合焓) ;
2, 对被research体系of溶剂性质, 光谱性质and电学性质etc.没have任何限制条件, 即具have非Specificityof独特优势;
3, 样品用量小, Sensitivity高且精确度高;
4, 可测of亲and力范围从10-2 M~10-12 M;
5, 实验时间较短, 且操作simple (高自动化) ;
6, 无需through荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰;
7, 测量时不need制成透明溶液;
8, 不破坏样品结构, 量热实验完毕, 还can进行后续生化analyze.
用途
TCisbased on复合物形成时所放出或吸收of热量of精确determine, 它isin一pcs实验中be able to同时测量所have结合参数of先进技术. ITC样品池中protein分子of工作浓度范围is10~100 M, 加样针内药物分子of工作浓度范围0.5~1 mM, 两者相互作用of滴定曲线由ITCanalyze软件NanoAnalyze来process, can拟合得到相应曲线. 获得生物分子相互作用of完整热力学参数, including解离常数(Kd), 结合常数(Ka), 结合位点数(n), 摩尔结合焓 (ΔH),摩尔结合熵 (ΔS), 吉布斯自由能(ΔG), 摩尔恒压热容(ΔCp)and动力学参数 (such asenzyme活力,enzyme促反应米氏常数(Km)andenzyme转换数) .
应用范围
1, protein-protein相互作用(includingantigen-antibody相互作用and分子伴侣-substrate相互作用); 2,protein折叠/去折叠;
3, protein-小分子相互作用as well asenzyme-抑制剂相互作用;
4,enzyme促反应动力学;
5, 药物-DNA/RNA相互作用;
6, RNA折叠;
7, protein-nucleic acid相互作用;
8, nucleic acid-小分子相互作用;
9, nucleic acid-nucleic acid相互作用;
10, 生物分子-cell相互作用.
1, research目ofproteinwith抗癌药物of结合作用
according to抗癌药物withproteinDPF2C2H2of滴定曲线, canobserve出顺铂withprotein能发生相互作用. 然后adoptinganalyze软件NanoAnalyze对ITC实验数据进行analyze并拟合曲线, through浓度梯度探索, most终Experimental Results显示: 当顺铂, proteinof工作浓度各for1 mM, 0.025 M时, 即二者浓度比for40倍时, 得到ofS曲线most好, 相互结合作用most佳, 滴定曲线such as下图所示.
2, 探究抗癌药物withDNAof相互作用
盐酸阿霉素 (DOX) withDNA作用ofITC曲线such as图, adoptingNanoAnalyze软件analyze得到of热力学参数列于表中. 对于第一类结合, ΔH1＜０, ΔS1＞０is一pcs稍have放热而熵增明显of过程, 且结合平衡常数较大, 这两种情况都会引起过程放热, 所以第一类结合表现for焓－熵协同驱动过程, 驱动作用力mainlyfor静电作用. 对于第二类结合, ΔH2＞０, ΔS2＞０is吸热且熵增明显of过程, 结合平衡常数较小, 这可能is因forDOXof疏水平面部分较深地嵌插至ＤＮＡ分子of疏水部分, 并且DOX进入之后又会使原来处于较深层疏水空腔of全部或部分溶剂水分子进入溶液本体, 转变for自由水分子, 使混乱度增加, 故表现for疏水作用for主of熵驱动过程. 一定of温度and压力下, 两类结合ofΔG值均for负值, 说明两类结合过程均can自发地进行, 且生成of产物分子结构relativelystable.
3, 探索proteinwith小分子of相互作用
research了四种钙盐滴定酪protein磷酸肽CPP后of热力学变化, such as下图所示. 不同of钙盐滴定 CPP 后of焓变, 熵变及自由能均无显著性差异 (p>0.05) . 此外, 不同钙盐with CPP 结合of焓变均大于 0, for吸热反应, 这with之前ofresearch一致.
此外, 吉布斯自由能 ΔG (kcal/mol)均小于 0, 表示模拟小肠末端环境下, CPPwith四种钙盐均自发进行反应. 并且, 由于-TΔS 均大于ΔH, 导致ΔG 小于 0, 表明熵变克服了焓变, 因此该反应is由熵驱动of, 离子相互作用力is该过程ofmainly推动力.
nucleic acid-小分子, 生物分子-cell相互作用, enzyme促反应动力学etc., candetect任意两种小分子之间of结合力, 要求detect样品of纯度高.
providemost少样品量: protein2mg, 小分子10mM/500ul, 样品浓度越高越好, protein多肽需低温寄送.
参考文献
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[2]王欢,苟杏杏,蒲小华,王姣,胡小兵,李宗孝.光谱及etc.温滴定量热法探究盐酸阿霉素withDNA作用机理[J].光谱学with光谱analyze,2018,38(02):540-545.
[3]罗敏娜,肖杰,张惜君,李伟,曹素芳,彭小雨,曹庸.etc.温滴定量热法探索酪protein磷酸肽单体with不同钙盐of相互作用[J].现代食品科技,2020,36(10):86-92.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2020.10.0150.
