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免疫印迹 (immunoblotting) 又称protein印迹(Western blotting) , isaccording toantigenantibodyofSpecificity结合detect复杂样品中of某种proteinof方法. 该法isin凝胶电泳and固相免疫determine技术基础上发展起来of一种新of免疫生化技术. 由于免疫印迹具have SDS-PAGE of高分辨力and固相免疫determineof高Specificityand敏感性, 现已成forproteinanalyzeof一种常规技术. 免疫印迹常用于identify某种protein, 并能对protein进行定性and半定量analyze. 结合化学发光detect, can同时relatively多pcs样品同种proteinof表达量差异.
将混合antigen样品in凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜with凝胶相贴. in印迹纸of自然吸附力,电场力或其它外力作用下, 使凝胶中of单一antigen组copies转移到印迹纸上, 并且固相化. most后应用免疫覆盖液技术such as免疫同位素探针或免疫enzyme探针etc., 对antigen固定化基质膜进行detectandanalyze.
免疫印迹法 ( 以antigenanalyzefor例) 基本上可分forantigen分离, antigen印迹andantigen检定三pcs步骤. in每一步中因adoptingof具体Experimental Methods不同, 可构成多种免疫印迹analyze系统.
免疫印迹法is一项analyzeantigen, antibodyof技术.
它具have下列优点:
1 湿of固定化基质膜柔韧, 易于操作;
2 固定化of生物大分子可均一ofwith各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔;
3 免疫印迹analyze只需少量reagent;
4 incubate, washof时间明显减短;
5 可同时制作多pcs拷贝, 用于多种analyzeandidentify;
6 结果以图谱形式可长期store;
7 免疫探针可through降低PH值etc.方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行analyzedetect.免疫印迹法of应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法of深入research而不断发展and完善.
1.WBdetecttissue量要求for100mg (即黄豆大小) ;
2.cell量要求for10^6及以上, cell收集方式 - - 贴壁cell: 倒掉Culture Medium,pbs清洗2-3times, 用cell刮收集cell, 2000g, centrifuge5min, 然后去掉上清液, cell沉淀干冰transport; 悬浮cell:2000g, centrifuge5min, 然后收集cell沉淀, 干冰transport;
3.血液样本: 全血adoptingEDTA-抗凝管装, 至少1ml, 4度transport, Serum或白celladopting干冰transport;
无信号或信号弱:
可能原因: antibody不匹配, antibody浓度过低, 样本中protein含量低, protein降解, 转膜效率低, 洗膜过度etc..
解决方案: optimizeantibody选择, 提高antibody浓度, 增加样本量, 确保样本新鲜, optimize转膜条件, 减少洗膜times数或降低洗膜强度.
背景高:
可能原因: 封闭不完全, antibody非Specificity结合, 曝光时间过长etc..
解决方案: 延长封闭时间, 选择合适of封闭液, optimizeantibody稀释度, 降低曝光时间.
条带形状异常(such as条带弯曲, 断裂etc.) :
可能原因: 凝胶制备不均匀, 电泳条件不当, 转膜过程中出现Questionetc..
解决方案: optimize凝胶制备过程, 调整电泳条件, 确保转膜过程中of均匀性andstable性.
条带位置with预期不符:
可能原因: 样本中protein分子量with预期不符, 电泳条件不当, 转膜过程中出现Questionetc..
解决方案: 重新confirm目标proteinof分子量, 调整电泳条件, 检查转膜过程中ofQuestion.
重复性差:
可能原因: 实验操作不一致, 样本process不当, reagentbatchestimes差异etc..
解决方案: 确保实验操作标准化, 严格控制样本process过程, using同一batchestimesofreagent.
protein免疫印迹实验 (Western Blot, 简称WB) is一种常用of生物化学技术, 用于detectproteinin样本中of表达水平. in进行WB实验时, 可能会遇到一些常见Question, 下面列举了一些常见Question及其可能of原因and解决方案:
in进行WB实验时, neednote实验操作of细节and标准化, 同时according toExperimental Results进行适当ofoptimizeand调整. 此外, 还neednotereagentof质量andbatchestimes差异, as well as样本ofstoreandprocess过程, 以避免出现常见Question.
