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免疫荧光法 (Immunofluorescence method) is将免疫学方法(antigenantibodyspecific结合)with荧光标记技术结合起来researchspecificproteinantigenincell内分布of方法. 由于荧光素所发of荧光可in荧光显微镜下检出, 从而可对antigen进行cell定位. 用免疫荧光技术显示and检查cell或tissue内antigen或半antigen物质etc.方法称for免疫荧光cell(或tissue)化学技术.
免疫荧光cell化学isaccording toantigenantibody反应of原理, 先将已知ofantigen或antibody标记上荧光素制成荧光标记物, 再用这种荧光antibody(或antigen)作for分子探针检查cell或tissue内of相应antigen(或antibody). incell或tissue中形成ofantigenantibody复合物上含have荧光素, utilizing荧光显微镜observe标本, 荧光素受激发光of照射而发出明亮of荧光(黄绿色或桔红色), can看见荧光所inofcell或tissue, 从而确定antigen或antibodyof性质, 定位.
免疫荧光检查样本of要求including以下几pcs方面:
1.取材手法: 要求取材器械锋利, 尽可能选择薄of手术刀片, 减少剪刀ofusing, 以避免挤压挫伤标本. 取材时应尽量accurate地取到目of部位tissue, 夹取标本时尽量远离目of区域tissue. 取材速度应尽量保证样本离体后5minutes内放入到合适of固定液内. such as果一只动物同时取多种器官, 应优先取消化器官, 其times取中枢神经系统器官 (such as脑, 脊髓etc.) , 皮肤, 肌肉etc.可放到most后取.
2.tissue块大小: 未经灌注of标本tissue厚度不应超过1cm. 对于cell爬片, Cell Density应合适 (most好is10^5) , 状态良好. cell爬片一times应做完, store不超过一weeks. such as果cell数量少, 太少of爬片不要进行免疫荧光detect.
3.固定液: 针对不同of标本特点及实验目of, 一定要选用正确of固定液. tissue应当用10%中性福尔马林固定, 正常固定时间for18-24hours.
4.切片要求: 对于石蜡切片, 切片放置时间不能超过半年, 否则存inantigen丢失of可能性, 结果可能for阴性或阳性较低. 切片厚度不应超过10um. 对于冰冻切片, 放置时间不能超过三pcsmonths, 且应storein-20℃. 20um厚of冰冻切片容易掉片, 而8-10umof切片则较for适宜.
请note, 这些要求可能会因实验室of具体条件and实验目of而have所不同. 因此, in实际操作中, recommendContact Us实验室of具体要求and指导, 以确保样本of质量andAccuracy.
1.目标proteinof荧光很弱, 导致组间差异不明显, 可能造成假阴性结果. 这可能is由于antibody不适用于特定of预processtissue, antibody修复不充分, orantibody浓度不当etc.原因导致of. for了解决这pcsQuestion, needconfirmantibodyof适用性, optimizeantibody修复条件, as well as调整antibody浓度.
2.信号弱或无信号, staincell过少. 这可能is由于目标proteinincell中没have表达, 表达目标proteinofcell过少, cell通透性差, antigen表位被破坏, antibody不识别, antibody稀释度过大, or二抗选择错误etc.原因引起of. canthroughvalidate目标proteinof表达, 增加cell数量, optimize通透剂ofusing, 换用其他固定方法, 调整antibody稀释度, or选择正确of二抗来解决这pcsQuestion.
3.protein荧光太强, 形成非Specificity标记, 导致背景stain可能被误认for阳性区域, 造成假阳性结果. 这可能is由于antibody浓度过高, incubate时间过长, orreagent质量etc.Question引起of. canthrough降低antibody浓度, 缩短incubate时间, or更换reagent来optimize结果.
4.tissue切片预process不当或adopting石蜡切片, 导致高背景stain. 这可能is由于固定液选择不当, 固定时间不足或过长, or切片放置时间过长etc.原因引起of. needoptimizetissue切片预process条件, 选择合适of固定液and固定时间, as well as确保切片of新鲜度.
