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外泌体iscell外囊泡 (EVs) ofmainly亚类之一, 几乎所have类型ofcell都会分泌外泌体, 广泛存in于体液中. 它们can携带特定of信号分子介导cell间通讯, 调节受体cellof生理and病理状态, 参with多种疾病of发生and发展. 因此, 外泌体可作for某些疾病of诊断生物标志物. most近, based on外泌体of无cell疗法引起了医学界of极大兴趣, 外泌体作for药物递送系统ofresearch也引起了许多research人员of极大关注.
外泌体ofmainly分离提取技术
超速centrifugeis分离不同生物成分most常用of方法, 被认foris外泌体分离of经典方法. 可分for密度梯度超速centrifugeand差速超速centrifuge (DUC) .
1.1差速超速centrifuge
DUC ismost早andmost常报道of外泌体分离策略. Operating Stepssuch as下图所示. 该方法过程simple, 不引入其他标记, 适用于大剂量样品analyze. 然而, 鉴于cell外液具have高度异质性, DUC 可导致非理想of外泌体聚集; 因此, 它可能不is一种合适of外泌体纯化方法, 因for大小相似of不同囊泡andprotein聚集体canin 100,000 × g 下共同形成. 因此, 应进一步纯化using该方法制备of外泌体. 此外, centrifuge力会导致外泌体结构of破坏, 进而影响下游实验, especiallyis外泌体of功能analyze.
based on差速超速centrifugeof外泌体分离示意图. 差速超速centrifugeisthroughcentrifuge力in 300 × g 到 100,000 × g 范围内of多循环centrifuge来进行of. through控制不同ofcentrifuge力and时间段, 依times去除cell, cell碎片and凋亡小体. most后一timescentrifuge (即 100,000 × g) 后, through去除上清液收集外泌体. centrifuge机in 4 °C 下运行.
based on差速超速centrifugeof外泌体分离示意图. 差速超速centrifugeisthroughcentrifuge力in 300 × g 到 100,000 × g 范围内of多循环centrifuge来进行of. through控制不同ofcentrifuge力and时间段, 依times去除cell, cell碎片and凋亡小体. most后一timescentrifuge (即 100,000 × g) 后, through去除上清液收集外泌体. centrifuge机in 4 °C 下运行.
1.2密度梯度超速centrifuge
密度梯度超速centrifugeis一种based onDUCof改进技术, 它is将样品颗粒加入具have密度梯度of惰性介质 (such as蔗糖and氯化铯) 中, 从而utilizing颗粒密度with媒介. 不同of粒子in一定of相对centrifuge力of作用下, 集中in梯度介质中of特定位置. most后, 获得不同of区域, 以便can从不同of区域收集各种高纯度颗粒. 该方法适用于沉降系数略have差异of颗粒of分离. 鉴于不同cell外成分之间固haveof密度差异, using该方法can获得更纯化of外泌体 . 步骤such as下图所示.
based on梯度密度超速centrifugeof外泌体分离示意图. Aetc.密度密度梯度超速centrifuge. B移动区梯度超速centrifuge. 该技术can分离沉降系数较差of颗粒, such asDUC, 也can分离具have一定密度差of颗粒. 粒子保持活性, 不会挤压或变形. based on梯度密度超速centrifugeof外泌体分离示意图. Aetc.密度密度梯度超速centrifuge. B移动区梯度超速centrifuge. 该技术can分离沉降系数较差of颗粒, such asDUC, 也can分离具have一定密度差of颗粒. 粒子保持活性, 不会挤压或变形.
2.超滤 (UF) - - 被动隔离方法
UF ofmainly原理涉及using具have指定孔径或截留分子量 (MWCO) of膜来分离预定尺寸范围内of颗粒. 因此, 它is一种based on尺寸of隔离技术. based on这一原理, 两种类型of超滤装置得到了很好of发展: 串联配置of超滤and顺序超滤. 外泌体回收率取决于过滤器of类型. in之前ofresearch中, observe到孔径for 10 kDa of纤维素膜具havemost高of回收效率 . UF can大大缩短process时间并且不need特殊equipment.
based on超滤of外泌体分离示意图. 串联配置of超滤. 当生物流体through两层膜时, includingcell碎片, 凋亡小体andcellin内of大囊泡被困in 200 nm of膜中, 而直径in 20-200 nm 范围内of囊泡则保留in下方 20 nmscreen. B连续超滤. 较大of颗粒 (for example, cell或cell碎片) 首先through 1000 nm 过滤器去除; 然后将滤液through第二pcs过滤器, 截留值for 500-kD, 以去除游离protein; most后, through 200 nm 过滤器从滤液中收集直径in 50-200 nm 范围内of外泌体.
3.体积排阻色谱法 (SEC) - - 被动分离方法
SEC using初始生物流体作for流动相, using多孔凝胶过滤聚合物作for固定相. 固定相of性质允许不同of洗脱: 首先洗脱较大of颗粒. 它们之后is较小of囊泡, 然后is非膜结合protein (因for较大of颗粒canthrough较少of孔, 它们through较短of路径到达柱of末端并更快地洗脱) . 因此, 不同阶段of洗脱液含have不同大小of颗粒.
| 血浆/Serum3-5ml | |
| cell上清>200ml | |
| EV>0.5mg |
外泌体is什么?
外泌体is一种由cell释放到cell外空间of纳米级囊泡, 携带了来自母cellofprotein, mRNA, miRNAetc.生物活性物质. 它们incell间通讯, 免疫调节, 疾病诊断with治疗etc.领域具have广泛of应用前景.外泌体提取of方法have哪些?
外泌体提取of方法including超速centrifuge法, 密度梯度centrifuge, 超滤centrifuge, 磁珠免疫法, 聚合物沉淀法as well askit提取etc.. 每种方法都have其优缺点, 选择哪种方法取决于实验of具体需求, such as外泌体of纯度, 数量as well as后续实验of要求etc..such as何保证外泌体of纯度?
保证外泌体of纯度is提取过程中of关键. canthroughoptimize提取方法, using高纯度ofreagentand器材, 严格控制实验条件etc.方式来提高外泌体of纯度. 此外, 对提取出of外泌体进行identifyandQuality Control也isveryimportantof步骤.外泌体提取后such as何store?
外泌体提取后应尽快进行后续实验, 以保证其生物活性andstable性. such as果need暂时store, can将外泌体storein适当of温度 (such as4°C) 下, 并避免反复冻融. 长期store则recommendadopting冷冻方式, 并in冷冻前加入适量of保护剂以减少冷冻对外泌体of损伤.外泌体提取过程中neednote什么?
in外泌体提取过程中, neednote避免外泌体of污染and损失. 同时, 要严格控制实验条件, such as温度, pH值etc., 以保证外泌体of完整性and生物活性. 此外, 对于涉及生物safe性of实验, 还neednote遵守相关of生物safe规定and操作流程.
外泌体提取is一pcs复杂且精细of过程, 涉及多pcs步骤andnote事项. 以下is一些关于外泌体提取of常见疑问及其解A:
