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向真核cell中导入DNAmainlyhave瞬时转染withstable转染, 统称forcell转染. 常规转染技术可分for两大类, 一类is瞬时转染, 一类isstable转染. stable转染is将重组DNA永久性of导入宿主cell, 此时of目ofgene会整合进入宿主cellstain体DNA中, 并指导cell中相应大proteinof表达, 同类型不同cell会存in本底表达水平of差异, 因此构建稳转cellin表达效果上会略低于瞬转cell, most终through抗性screenand指示标记可获得目ofcell, usuallystable转染cell可反复using, 多用于后续动物etc.实验. 平台可provide性价比高质量stableofcell株构建服务, 并haveprofessionalof技术团队for您of需求定制相关cell株或设计相关实验.
技术路线
载体选择:
载体名称 | pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro | pLVX-IRES-ZsGreen1 | pLVX-shRNA2-Puro | pLVX-shRNA2-Neo |
质粒类型 | 哺乳动物cell慢virus表达载体 | 哺乳动物cell慢virus表达载体 | RNAi载体 | 慢virus表达载体, RNAi载体 |
高拷贝/低拷贝 | 高拷贝 | 高拷贝 | 高拷贝 | 高拷贝 |
启动子 | CMV | CMV | U6 | U6 |
克隆方法 | 多克隆位点, 限制性内切enzyme | 多克隆位点, 限制性内切enzyme | 多克隆位点, 限制性内切enzyme | 多克隆位点, 限制性内切enzyme |
载体大小 | 8196 bp | 8204 bp | 8998 bp | 9070 bp |
载体抗性 | 氨苄 | 氨苄 | 氨苄 | 氨苄 |
screen标记 | 嘌呤霉素(Puromycin),ZsGreen1 | 嘌呤霉素(Puromycin) | 嘌呤霉素(Puromycin) | 嘌呤霉素(Puromycin) |
备注 | 载体be able to同时表达ZsGreen1荧光protein, 嘌呤霉素and目ofgene. | 载体be able to同时表达ZsGreen1荧光proteinand目ofgene. | 载体be able to同时表达ZsGreen1荧光proteinand目ofgene. | 载体be able to同时表达ZsGreen1荧光proteinand目ofgene. |
1.cell费用 (目ofcell)
①cellusing费500/株cell;
②代购cell, 1.5-4K不etc. (到货weeks期会have影响) ;
③clientprovidecell (冻干cell2支, 状态不佳会影响转染效果, 支原体detect不收取费用) .
2.套餐费用 (含reagent, Cell Culture费用)
A套餐: 载体构建
B套餐: 载体构建+virus包装
C套餐: 载体构建+virus包装+stable表达cell株screen
交付结果 (分forA, B, C三pcs套餐)
A套餐: gene合成报告, 菌液PCR报告/双enzyme切Detection Report, 菌液 (目of组) 1mL, 质粒 (目of组) 5μg.
B套餐: gene合成报告, 菌液PCR报告/双enzyme切Detection Report, 滴度detect结果, 支原体detect结果, 纯化virus液 (空载组, 目of组) 各200μL.
C套餐: gene合成报告, 菌液PCR报告, 滴度detect结果, 支原体detect结果, 稳转株流式detect结果/抗性detect结果, WBdetect结果(可选) , 单克隆cell结果, 冻干cell株-可选复苏cellor冻存cell (空载组, 目of组) 各2支.
交付weeks期
测试weeks期for收到cell后of6-8weeks左右.
1.慢virus包装of应用
慢virus (lentivirus , LV) 属于逆转录virus科, 该种virus感染pcs体of潜伏期长达数年, 之后缓慢发病, 因此这些病原体被称for慢virus. 慢virus (Lentivirus) 载体is以HIV-1(人类免疫缺陷I型virus) for基础发展起来ofgene治疗载体, is目前cell及模式生物实验中veryhave效of工具, ingene转染方面have着许多独特of优势, 对分裂celland非分裂cell均be able tohave效感染, 可容纳较大gene片段, 同时be able to将携带ofgenestableof整合到gene组中etc.优势, 慢virus包装逐渐成for科研必备of实验技能之一, 多用于感染各种肿瘤cell, 建立stable表达或沉默目ofproteinofcell株. 此外, we还can构建真核, 原核表达载体; provide高滴度慢virus液.
2.such as何选择合适of载体?
1.过表达载体
①according to启动子来选择载体: 对于哺乳动物cell来说, 常见载体of泛表达启动子常见of基本includingCMV, SV40, EF1a, CAG. 大部分都选择CMV,CAGorEF1a其中之一即可,SV40表达能力稍弱.
②according to载体选择标记(Selectable Markers)来选择载体: 载体of选择标记mainly目ofis区分表达于非表达目ofgeneofcell. relatively常用of选择标记havePuromycin,Blasticidin,Neomycin,Zeocinand各种荧光proteinsuch asZsGreen,EGFP,RFP mCherryetc., we一pcsgeneusually只需选一种即可.
2.干扰载体
这类载体of选择要simple很多, 启动子选择U6,CMV即可. 但标记选择usually跟过表达类似, 尽量选PuromycinandZsGreen.
3.for什么stablecell株构建weeks期长?
cell株构建服务including目ofgene表达慢virus载体构建, virus包装, cell转染, 稳转cell株screenandcell株identifyetc.5pcsExperimental Procedure. 其中慢virus载体构建, virus包装, cell转染etc.步骤进展relatively快, in稳转cell株screen及identify这步need较长of时间, for了保证cell株进行多times传代后, 仍然保持其遗传stable性, wethrough流式cell仪or抗性标记screen出100-200pcs高水平表达克隆, 并从中挑选most佳3-5pcs高产克隆cell, 这些克隆cellin温暖ofculture环境中慢慢地分裂成2pcs,4pcs,8pcs.....终于in10-15daysof时候长成一pcscell团, 这pcs时候for了保证克隆cellofstable性, 技术人员将对该cell团进行第二轮of亚克隆, 甚至要进行第三轮亚克隆就能挑选出stable表达of单克隆cell.
