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免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) is以antigenantibody之间of专一性作用for基础用于确定两种proteinin完整cell内生理性相互作用ofhave效方法. 当cellin非变形条件下被裂解时, 完整cell内存in许多protein-protein间of相互作用被保留了下来. such as果用预先固化inagarose beads上ofproteinAofantibody免疫沉淀Aprotein, 那么withAproteinin体内结合ofproteinB也能一起沉淀下来, 再throughprotein变性分离, 对Bprotein进行detect, 以证实两者存in相互作用. 这种方法常用于determine两种目标proteinis否in体内结合, 也可用于确定一种特定proteinof新of作用搭档.
1. IP级别ofantibody; needresearchofprotein互作信息 (protein名称, 大小, 种属etc.)
2．实验样本: tissue样品>200mg, cell样品>2 x 107 , protein样品大于2ml.
免疫共沉淀 (Co-IP) 实验中可能会遇到多种常见Question, 以下is一些常见ofQuestion及其可能of原因and解决方案:
1, 高背景:
可能原因: 非Specificityprotein结合, 转移膜上of非Specificity吸附etc..
解决方案: in无Serumculture液中裂解cell以减少非Specificityprotein结合; note实验操作, 戴手套, 用镊子夹取, 不接触转移膜转移面etc.以避免非Specificity吸附.
2, 实验失败:
可能原因: 样品被proteinenzyme降解, antibody浓度太低或亲and力低, IPantibody未withagarose珠子结合etc..
解决方案: in裂解样品中加入proteinenzyme抑制剂, note冰上操作, 避免反复冻融; 调整antibody浓度, 必要时设立浓度梯度, 摸索most佳浓度; 选用合适ofagarose珠子, 正确store防止变质或干燥.
3, antibody选择:
选择Specificity好ofantibody, can考虑using单抗.
4, 未detect到互作protein或信号太弱:
可能原因: 裂解液中去垢剂浓度过高或配方太强烈, proteinandprotein之间of相互作用太弱或不stableetc..
解决方案: optimize裂解液配方, 降低去垢剂浓度; 尝试using不同ofcell或tissue裂解条件; 确保样品新鲜, 并加入proteinenzyme/磷酸enzyme抑制剂.
5, Co-IPvalidate结果with其他validate方式不一致:
可能原因: Co-IP中存in中间protein参with互作, 而其他validate方式无法detect到这种互作.
解决方案: 综合考虑多种validate方式of结果, 结合其他实验数据进行analyze.
6, 选择合适ofInputcontroland同型control:
using实验usingofcell裂解液作forInputcontrol, 同型controlcan选择with实验antibody相同种属但Specificity不同ofantibody.
7, 互作validate一定要usingWestern Blot吗?
可见protein只能判断protein大小, 不能确定is否for目ofprotein, 因此usuallyneedWestern Blot进行confirm.
8, Inputof带型不够亮:
解决方案: can尝试瞬转过表达process.
9, antibody浓度and加样量:
usuallyneed进行optimize, 摸索most佳antibody浓度and加样量.
10, 避免假阳性:
选择Specificityantibodyis关键, Specificityantibodycan排除非Specificity结合进而排除假阳性.
