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所谓实时荧光定量PCR技术, is指inPCR反应体系中加入荧光基团, utilizing荧光信号积累实时监测整pcsPCR进程, most后through标准曲线对未知模板进行定量analyzeof方法.
DNA结合染料法 | based on探针of化学法 | 猝灭染料引物法 | |
|---|---|---|---|
举例 | SYBR Green I | TaqMan, 分子信标, Scorpionand杂交探针 | AmplifluorandLUX荧光引物 |
基本原理 | 应用一种带have荧光of, 非specificofDNA结合染料detectPCR过程中积累of扩增产物. | 应用一pcs或多pcs荧光标记of寡核苷酸探针detectPCR扩增产物; 依赖荧光能量共振传递 (FRET) detectSpecificity扩增产物. | adopting荧光标记引物扩增, 从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中; 依赖荧光能量共振传递 (FRET) . |
Specificity | detect所have双链DNA扩增产物, including非specific反应产物, such as引物二聚体. | 仅detectSpecificity扩增产物. | detectSpecificity扩增产物及非specific反应产物, such as引物二聚体. |
应用 | DNA及RNA定量; gene表达validate | DNA及RNA定量; gene表达validate; etc.位gene鉴别; SNP分型; 病原体andvirusdetect; 多重PCR | |
优点 | 可对任何双链DNA进行定量; 不need探针, 因此减少了实验设计及运转成本; 适合于大量geneofanalyze; simple易用. | 探针and目标片段ofSpecificity结合产生荧光信号, 因此减少了背景荧光and假阳性; 探针可标记不同波长of荧光基团, 用于多重PCR反应. | |
缺点 | 由于染料可同时detectSpecificity及非SpecificityPCR产物, 因此会产生假阳性; needPCR后process过程. | 对于不同of靶序列need合成不同of探针, 原料成本较高. | |
Detection Method
1.SYBRGreenⅠ法:
inPCR反应体系中, 加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料Specificity地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中ofSYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号of增加withPCR产物of增加完全同步.
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图 (单一峰图表明PCR扩增产物of单一性)
2.TaqMan探针法:
探针完整时, 报告基团发射of荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Taqenzymeof5’-3’外切enzyme活性将探针enzyme切降解, 使报告荧光基团and淬灭荧光基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光信号, 即每扩增一条DNA链, 就have一pcs荧光分子形成, 实现了荧光信号of累积withPCR产物of形成完全同步.
技术原理
将标记have荧光素ofTaqman探针with模板DNA混合后, 完成高温变性, 低温复性, 适温延伸of热循环, 并遵守聚合enzyme链反应规律, with模板DNA互补配对ofTaqman探针被切断, 荧光素游离于反应体系中, in特定光激发下发出荧光, 随着循环times数of增加, 被扩增of目ofgene片段呈指数规律增长, through实时detectwith之对应of随扩增而变化荧光信号强度, 求得Ct值, 同时utilizing数pcs已知模板浓度ofstandard作control, 即可得出待测标本目ofgeneof拷贝数.
Ct 值
Ct值 (Cycle threshold, 循环阈值) of含义for: 每pcs反应管内of荧光信号到达设定阈值时所经历of循环数.
临床疾病诊断
各型肝炎, 艾滋病, 禽流感, 结核, 性病etc.传染病诊断and疗效evaluate; 地中海贫血, 血友病,性别发育异常, 智力低下综合症, 胎儿畸形etc.优生优育detect; 肿瘤标志物及瘤genedetect实现肿瘤病诊断; 遗传genedetect实现遗传病诊断.
动物疾病detect
禽流感, 新城疫, 口蹄疫, 猪瘟, 沙门菌, 大肠埃希菌, 胸膜肺炎放线杆菌, 寄生虫病etc.,炭疽芽孢杆菌.
食品safe
食源microorganism, 食品过敏源, 转gene, 乳品企业阪崎肠杆菌etc.detect.
科学research
医学, 农牧, 生物相关分子生物学定量research.
应用行业
各级各类医疗机构, 大学及research所, CDC, 检验检疫局, 兽医站, 食品企业及乳品厂etc..
由于qPCRis实时定量detect致病病原体genenucleic acid, 因此它比化学发光, 时间分辨,protein芯片etc.免疫学方法更具独到优势.
1. 请provide已知of全长gene序列and详细背景资料: DNA/RNA来源, 丰度;
2. 请您provide新鲜of且尽量多of材料, 或直接provide纯化好of总RNA或DNA(大于5ug/样本) .
3. 动物tissue: 样本离体应当立即放入液氮或-80℃冰箱中速冻store, 避免反复冻融, 并且样本in-80℃ofstore时间不宜过长, 若store时间超过半年应及时with工作人员取得联系, tissue寄送100mg以上, 脂肪tissue, 结缔tissue, 纤维化tissue适当增加, 干冰transport;
4.植物:新鲜of叶, 果肉, 种子etc.most少需100mg, 干冰transport.
5.cell:1×10^6pcscell, 加入trizolofcell样本 (不要直接transport加trizolofCell Culture皿) , Trizol for裂解液, 不适用于tissue样本ofstore, cell除外, 干冰transport;
6.全血: most少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管, 4度transport; Serum: most少1 mL, 干冰transport;
7.RNA样品:OD260/280for1.8-2.0, 浓度≥100 ng/μL, 体积≥20μL, 干冰transport; cDNA: cDNA原液≥20 μL, 干冰transport;
8. 对于完成实验后, 剩余样本need返还of项目, 需in收到项目完整版结题报告一pcsmonths内告知公司, 逾期样本将安排清理.
Q1, 1.无Ct值出现
detect荧光信号of步骤have误:generallySybrGreen法adopting72℃延伸时采集, Taqman法则generallyin退火结束时或延伸结束采集信号.
1, 引物或探针降解:可throughPAGE电泳detect其完整性.
2, 模板量不足:对未知浓度of样品应从系列稀释样本ofmost高浓度做起.
3, 模板降解:避免样品制备中杂质of引入及反复冻融of情况.
Q2, 2.Ct值出现过晚 (Ct>38)
1, 扩增效率低:反应条件不够optimize. 设计更好of引物或探针; 改用三步法进行反应; 适当降低退火温度; 增加镁离子浓度etc..
2, PCR各种反应成分of降解或加样量of不足.
3, PCR产物太长:generallyadopting80-150bpof产物长度.
Q3, 3.溶解曲线不止一pcs主峰
1, 引物设计不够optimize: 应避免引物二聚体and发夹结构of出现.
2, 引物浓度不佳: 适当降低引物of浓度, 并note上下游引物of浓度配比.
3, 镁离子浓度过高: 适当降低镁离子浓度, 或选择更合适ofmixkit.
4, 模板havegene组of污染: RNA提取过程中避免gene组DNAof引入, 或through引物设计避免非specific扩增.
Q4, 4.扩增效率低
1, 反应reagent中部分成分especiallyis荧光染料降解.
2, 反应条件不够optimize: 可适当降低退火温度或改for三步扩增法.
3, 反应体系中havePCR反应抑制物: generallyis加入模板时所引入, 应先把模板适度稀释, 再加入反应体系中, 减少抑制物of影响.
