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DSF原理
差示扫描荧光法 (Differential Scanning Fluorimetry, 简称DSF) , isin荧光定量PCR仪上缓慢加热样品, in加热of过程中detect荧光染料with结构发生改变of蛋白质相结合of量, 来evaluateprotein热stable性of方法. 该方法具haveprotein样品损耗少, 通量高, 温度变化范围广及数据accurateetc.优点, 被广泛用于proteinstable性 (protein热stable性参数及其影响因素) , protein结构and构象, protein-配体相互作用及proteinstable剂, 抑制剂, 辅助因子etc.领域ofresearch.DSFcanthrough荧光染料或protein内源荧光信号监测升温过程中protein构象of变化计算其熔解温度Tm (折叠proteinwith去折叠protein相etc.时of温度) . 染料法DSFmost常用ofisSYPRO Orange染料, SYPRO Orange is一种环境敏感of疏水染料, 当温度升高时, protein去折叠, 疏水部分暴露出来, 染料withproteinof疏水部分Specificity结合, 荧光增强. inhave特定化合物或配体结合of情况下, proteinstable性会上升, 表现for熔解温度of上升.
无标记DSF (Nano DSF) 则isbased onprotein去折叠过程中色氨酸发射光谱of位移进行detect. 因此, throughdetect荧光变化, 可实现in非标记环境下评估protein热stable性, 化学stable性, 胶体stable性, etc.温stable性, 变复性能力etc.性质.
DSF优点
1, Nano DSF无需染料: 直接detectprotein紫外荧光;
2, 初步or大量detectproteinwith化合物之间is否have结合力;
3, 低样品消耗量: 每pcs样品仅需10 μL, most低浓度仅需0.5 μg/mL;
4, 数据精度高: CV<0.1% (Tm);
5, 温度变化范围广.
1, proteinstable性评估
大多数protein对温度要求较高, 评估其热stable性对更好地发挥其功能veryimportant. DSF不但can高通量determineproteinof热stable参数, 还能评估突变, pH, 离子强度etc.其他因素对热stable性of影响, screen出提高热stable性of因素.
2, protein结构research
protein结晶isresearchprotein结构of一pcsveryimportantof手段, DSFcan高通量screenproteinof结晶条件.
3, protein-配体相互作用research
配体withprotein结合generally会导致proteinof热stable性改变, DSFcanthroughdetermineproteinof热stable性参数评估配体withprotein之间of相互作用.
4, proteinstable剂, 抑制剂of高通量screen
through对化合物配体库进行高通量screen, 获得withprotein样品相结合of候选化合物, 评估化合物对proteinstable性of影响, 从而screen出proteinstable剂, 抑制剂, 辅助因子及分子伴侣
5, 小分子化合物抑制机制research
utilizing DSF can进行高通量, 矩阵式of多种化合物detect (化合物with一些已知of抑制剂, substrate, 产物或辅助因子etc.结合) , 用于小分子化合物抑制剂ofscreen及其药理机制ofresearch.
初步or大量detectproteinwith化合物ofis否have作用力.
detectproteinstable性.
musthave一种isprotein.
most少provide量: protein浓度10uM/15ul, 小分子10mM/15ul, protein多肽需低温寄送.
Sample Preparation: 确保样品of质量and纯度, 避免污染and降解. 对于protein样品, 可能need进行适当of折叠and纯化, 以确保其具have正确of结构and活性. 同时, note样品of浓度and体积, 以符合实验要求.
荧光染料选择: DSF实验常用of荧光染料includingSYPRO Orange, SYPRO Redetc.. according to实验需求and目of选择合适of荧光染料. 不同of染料可能对不同ofprotein具have不同of敏感性andSpecificity, 因此needaccording to实际情况进行选择.
温度范围设置: DSF实验need设置合适of温度范围, 以覆盖proteinof熔解温度 (Tm) . according to实验目ofandproteinof特性, 选择合适of起始温度, 终止温度and升温速率. 确保温度范围足够宽, 以充分observeproteinof热stable性变化.
instrument校准: in进行DSF实验前, need对荧光定量PCR仪进行校准, 确保温度控制and荧光detectofAccuracy. 定期检查and维护instrument, 以保证Experimental Resultsofreliable性.
Data Analysis: DSF实验产生of数据need进行适当ofanalyze以提取have用of信息. through荧光信号of变化, can计算proteinof熔解温度 (Tm) and其他相关参数. using合适of软件或工具进行Data Analysis, 并according toneed进行数据拟合and统计process.
实验Reproducibility: for了确保Experimental Resultsofreliable性, needin不同时间, 不同batchestimesand不同实验人员之间保持实验ofReproducibility. 这要求实验条件, equipment参数and样品process方法etc.都要保持一致, 并且need定期对equipment进行校准and维护.
差示扫描荧光法 (DSF) is一种常用ofanalyze技术, 广泛应用于proteinstable性, 结构and相互作用ofresearch. in进行DSF实验时, neednote以下几pcs方面:
总之, in进行差示扫描荧光法 (DSF) 实验时, neednoteSample Preparation, 荧光染料选择, 温度范围设置, instrument校准, Data Analysisand实验Reproducibilityetc.方面. through遵循这些note事项, can获得更accurate, reliableand可重现ofExperimental Results.
