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转录组测序 (RNA-Seq) is一种utilizing新一代高通量测序技术进行cDNA测序of技术, be able to全面rapid地获取某一物种特定器官或tissuein某一状态下of几乎所have转录本. 它反映了mRNA, smallRNA, noncodingRNAetc.or其中一些of表达水平.
转录组测序ofresearch对象for特定cellin某一功能状态下所能转录出来of所haveRNAof总and, mainlyincludingmRNAand非编码RNA. 这种测序技术无需预先设计探针, 即可对任意物种of任意cell类型of转录组进行detect, 并且能provide更精确of数字化信号, 更高ofdetect通量as well as更广泛ofDetection Range.
in测序建库of过程中, 会选择不同of片段大小, 以适应不同of测序对象. for example, mRNA测序时, usually会选择200-300 bp大小of片段进行建库, 并adopting125PE/150PE测序. 而对于长链非编码RNA (lncRNA) , 由于存in正向转录and反向转录, 因此常adopting去除rRNA后进行链Specificity建库测序of原则.
转录组测序技术已被广泛应用于各物种of基础research, 临床诊断and药物研发etc.领域. for example, in基础research中, 它可用于researchgene功能及结构, 揭示特定of生物学过程; in临床诊断中, 可用于疾病of早期诊断, 病情监测and预后评估; in药物研发中, 可用于新药of发现and药物作用机制ofresearch.
| Sample Type | 送样量 | 预processandstore |
| 动物tissue | ≥500 mg | 1) 无enzyme冻存管, 液氮中预冷; 2) 活体上迅速取下tissue (切成黄豆粒大小of块状) ; 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水rapid清洗tissue表面of污渍, 吸干表面液体后收集进冻存管 (管of下部分保持in液氮中) ; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store, 避免反复冻融; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| 植物表面tissue, 植物根部,茎, 叶子 | ≥2 g | 1) 无enzyme冻存管, 液氮中预冷; 2) 尽量选取新鲜, 幼嫩, 生长旺盛oftissue部位, 若for体积偏大of样本 (such as果实) , 尽量切成小块; 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水rapid清洗tissue表面of附着物, 吸干表面液体后收集进冻存管 (管of下部分保持in液氮中) ; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store, 避免反复冻融; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| 植物嫩叶片, 嫩芽 | ≥500 mg | 1) 无enzyme冻存管, 液氮中预冷; 2) 尽量选取新鲜, 幼嫩, 生长旺盛oftissue部位, 若for体积偏大of样本 (such as果实) , 尽量切成小块; 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水rapid清洗tissue表面of附着物, 吸干表面液体后收集进冻存管 (管of下部分保持in液氮中) ; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store, 避免反复冻融; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| culturecell | ≥1*10^7 | 1) 取生长状态良好cell, 确定cell数量; 2) 贴壁cell: 用1×PBS缓冲液washcell 1-2 times; 悬浮cell: centrifuge, 吸除Cell Culture液, 1×PBSwash, centrifuge弃PBS, 洗1-2times; 3) 加入适量Trizol裂解液反复吹打至裂解充分; 4) 转移至无enzymecentrifuge管中, -80 ℃store; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| 血液样品 | ≥250 μL | 1) using抗凝采血管采集全血; 2) 轻轻倒转采血管混合4-5times, 使抗凝剂with血液混匀; 3) rapid转移至单独of冻存管中, 按照250μl/管分装, 加750μl Trizol LS混匀; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| fungus菌丝体 | ≥600 mg | 1) 将fungus称重 (每管200mg) , 分装多管, 请provide不少于3管of菌丝体; 2) 将称重分装后offungus置于液氮中冷冻≥1h; 3) 转移至-80 ℃store; 4) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| RNA样本 | 1.总量≥2 μg, 浓度≥50 ng/μL, 2. OD260/OD280in1.8-2.2之间, RNA无降解, 28/23S (真核/原核) and18/16S (真核/原核) 核糖体RNA条带very亮且清晰, Aglient 2100detect仪analyzeRNA完整性数据RIN≥8 | 1) total RNAcanstorein焦碳酸二乙酯DEPCprocess过of水中, 75%of乙醇, 异丙醇中, 具体以什么方式store请注明; 2) 无protein, gene组DNA污染, such ashave污染请去protein并进行DNase Iprocess; 3) 避免反复冻融, 应对total RNA小量分装; 4) 样品请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
转录组测序 (RNA-Seq) is一种强大of技术, be able to全面rapid地获取某一物种特定器官或tissuein某一状态下of几乎所have转录本of信息. 以下is一些关于转录组测序of常见疑问及其解A:
1.什么is转录组测序?
转录组测序is一种utilizing新一代高通量测序技术, 对特定cell或tissuein某一功能状态下所能转录出来of所haveRNA进行测序of方法. 它canprovidemRNA, 非编码RNAetc.of表达水平信息.
2.for什么进行转录组research而不isgene组research?
转录组research关注ofisgeneof表达情况, 即哪些genein特定条件下被转录成mRNA. 而gene组research则关注geneof序列and结构. 转录组researchcan更直接地反映生物体of功能状态and生理过程, 因此in很多情况下更forhave用.
3.转录组测序can同时detectmRNA, miRNA及其他非编码RNA吗?
isof, 转录组测序can同时detectmRNA, miRNAas well as其他非编码RNA. 这种技术can对整pcs转录组进行全面ofanalyze, including不同类型ofRNA分子.
4.测序深度and覆盖度is什么意思?
测序深度指ofis测序得到of总读数或测序数据量, 而覆盖度则指ofis测序数据对gene组of覆盖程度. 测序深度and覆盖度is影响转录组测序结果of关键因素, needaccording to具体实验需求进行选择.
5.Q20, Q30所代表of碱基质量含义is什么?
Q20andQ30is评估测序数据质量ofimportant指标. Q20表示测序错误率for1%, 即每pcs碱基of测序Accuracy达到99%; Q30表示测序错误率for0.1%, 即每pcs碱基of测序Accuracy达到99.9%. 这些指标can帮助research人员评估测序数据of质量andreliable性.
6.Paired-endwithSingle-end表示什么意思?
Paired-endandSingle-endis两种不同of测序策略. Paired-end测序is指从样品of两端分别进行测序, 得到成对of末端读数, can用于确定转录本of结构and剪接位点; 而Single-end测序则只从样品of一端进行测序, 得到单一of读数.
7.原核生物with真核生物in进行转录组测序文库构建时have什么区别?
原核生物and真核生物in转录组测序文库构建时ofmainly区别in于RNAof提取and纯化方法. 原核生物ofRNAusually较forstable, can直接提取; 而真核生物ofRNA则存in较多of修饰and剪接现象, need进行更复杂ofprocessandanalyze.
8.转录组测序一定要设置生物学重复吗? such as果样品间差异不大还need设置吗?
设置生物学重复can提高转录组测序ofAccuracyandreliable性, 但并不ismustof. such as果样品间差异不大or实验条件verystable, can不设置生物学重复. 然而, for了获得更reliableof结果, recommend尽可能设置生物学重复.
9.转录组测序对样品have什么要求吗? 样品用量is多少?
转录组测序对样品of要求因实验类型and物种而异. generally而言, 样品shouldis高质量ofRNA, 且数量足够进行测序. 具体of样品用量取决于实验设计and测序平台of要求.
10.样品该such as何收集withprocess?
样品of收集andprocess方法因实验类型and物种而异. generally来说, need确保样品in收集过程中不受污染and损伤, 并尽快进行process以防止RNAof降解. process过程中可能need进行RNAof提取, 纯化andQuality Controletc.步骤.
以上is一些关于转录组测序of常见疑问及其Answer. 当然, 随着技术of不断发展and应用领域of拓展, 还可能出现更多新ofQuestionand挑战. 因此, inusing转录组测序技术进行research时, recommendwithweof实验人员或research人员进行充分沟通and讨论, 以确保实验of顺利进行and结果ofreliable性.
