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ITRAQ标记定量protein组学analyze
iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolutequantitation, iTRAQ)is由AB SCIEX公司研发of一种体外同重同位素标记of相对with绝对定量技术. 该技术utilizing4种或8种不同签of同位素reagentSpecificity地标记不同样品中ofprotein多肽氨基基团,标记of样品etc.量混匀后,经液相色谱分离及串联质谱(MS/M)analyze,可同时relatively4种或8种不同样品中proteinof相对表达量信息,through生物信息学analyze即可identify出所测protein及其in各样品中of表达差异 .
iTRAQreagent由三部分组成:报告基团, 质量平衡基团and反应标记reagent基团,形成4种或8种相对分子质量均etc.量(145或305)of异位标签iTRAQreagent用于标记enzyme解后of肽段. in质谱中,任何一种iTRAQreagent标记of不同样本中of同一肽段表现for相同of质荷比. in串联质谱中,报告基团, 质量平衡基团and多反应基团之间of键断裂,质量平衡基团丢失,带不同同位素标签of同一多肽产生不同of报告离子,according to报告离子of信号强度可获得样品间相同肽段of定量信息,再经过软件process得到proteinof定量信息.
技术特点:
1, Sensitivity高:可detect出较低丰度protein, 胞浆protein, 膜protein, 核protein, 胞外proteinetc.;
2, 分离能力强:可分离出酸/碱性protein, 小于10K或大于200Kofprotein, 难溶性protein;
3, 高通量:可同时对8pcs样本进行analyze, especially适用于adopting多种process方式或来自多pcsprocess时间of样本of差异proteinanalyze;
4, 结果reliableaccurate:定性with定量同步进行, 同时得出identifyand定量结果, 重复样品间ofprotein表达量相关性可达到0.95以上;
5, 兼容性高:标记所haveof肽段, including翻译后修饰, 提高了protein组of覆盖率, 而且提高了identifyand定量of可信度.
ITRAQ 标记定量流程:
项目实验流程
功能注释流程
部分结果图展示
| Sample Type | 送样量 | 预processandstore |
| 常规动物tissue (脑, 心, 肝, 脾, 肺, 肾, 肌肉, 皮肤etc.) | ≥50 mg | PBSwash去除残留血液and污染物, 迅速剥去脂肪and筋皮etc.结缔tissue, 冲洗干净. 用tissue剪或手术刀将tissue分离成1cm3左右of小块. 液氮速冻, storein-80°C, 干冰transport |
| 软体动物 (血吸虫, 旋毛虫etc.) | ≥500 mg | PBSwash去除来自宿主of污染. 液氮速冻, storein-80°C, 干冰transport |
| 动物软骨tissue | ≥200 mg | PBSwash, 用手术刀将软骨切成1cm3左右of小块. 液氮速冻, storein-80°C, 干冰transport |
| 动物毛发 | ≥200 mg | 用适量2%SDS, 50mM 磷酸钠 (pH7.8) 缓冲液漂洗样品, 去除污染物, 干燥, storein-80°C, 干冰transport |
| 柔软tissue (木本植物of叶, 花etc., 草本科植物, 藻类, 蕨类植物, 大型fungusetc.) | ≥100 mg | 收集样品, 液氮速冻 (such as果样品表面have泥土或明显污染物, 则液氮速冻前用PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体) , storein-80°C, 干冰transport |
| 木本科植物of树根, 树皮, 树枝etc. | ≥5 g | 收集样品, 液氮速冻 (such as果样品表面have泥土或明显污染物, 则液氮速冻前用PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体) , storein-80°C, 干冰transport |
| 果实, 种子 | ≥50 mg | 收集样品, 液氮速冻 (such as果样品表面have泥土或明显污染物, 则液氮速冻前用PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体) , storein-80°C, 干冰transport |
| 果肉 | ≥5 g | 去皮切成1cm3左右小块, 液氮速冻, store于-80°C, 干冰transport |
| 花粉 | ≥10 mg | 植物开花期收集花粉, 解剖显微镜下检查花粉, 用解剖针去除花药碎片etc.杂质, 转入EP管中, 光学显微镜下检查花粉of形态and纯度. store于-80°C, 干冰transport |
| bacteria菌类 | ≥50 mg | 3000g-5000gcentrifuge5-15min, 去上清, PBSwash沉淀三times, 液氮速冻, 菌体-80°Cstore, 干冰transport |
| fungus菌体 | ≥5 g | PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体, 液氮速冻, store于-80°C, 干冰transport |
| 悬浮culturecell | ≥2×10^7 | 1)400g-1000gcentrifuge10minutes收获cell, 弃上清. 2)用预冷ofPBS小心wash片状沉淀物2times, 置于冰上, 去上清. 3)液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 贴壁culturecell | ≥2×10^7 | 1)弃掉culture液, 并将culture皿倒置于吸水纸上吸干culture液 2) 加入4°C预冷ofPBS, 平放轻轻摇动1minuteswashcell, 然后弃去PBS. 重复以上操作两times以洗去culture液. 3)将culture皿置于冰上. 向culture皿内加入4°C预冷ofPBS. 用干净ofcell刮棒将cell刮于culture皿of一侧 (动作要快) , 冰上斜置culture皿, 使得缓冲液流向一侧. 移液管吸取溶解产物至预冷ofcentrifuge管内. centrifuge去上清. 4)液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| Serum | ≥100 μL | 收集好of全血室温静置两hours, 3000gcentrifuge10min, 取上清, 液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 血浆 | ≥100 μL | 收集好of全血加入抗凝剂, 室温静止30minutes, 1300g-2000gcentrifuge10min, 取上清, 液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 动物乳汁或人乳汁 | ≥3 mL | 收集母乳, -80°Cstore, 干冰transport. 若要去除样品中of高丰度酪protein, need超速centrifuge除去 |
| 乳脂肪球膜protein (MFGM) , 即脂质层 | ≥150 μL | 收集母乳, 4度高速centrifuge15min, 取脂质层, 用预冷of5倍体积ofPBSwash3times, 纯水wash一times, -80°Cstore, 干冰transport |
| 脑脊液, 关节液, 淋巴液, 附睾腔液 | ≥50 μL | 1000g-2000gcentrifuge5min, (或using0.22µm滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 唾液 | ≥100 μL | 禁食两hours以上, 9-12am取样, 1000g-2000gcentrifuge5min, (或using0.22um滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 泪液 | ≥300 μL | 收集样品 (可utilizingcapillary micropipette或Schirmer strip) , 8000-14000g 4度 centrifuge5min, 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 尿液 | ≥10 mL | 5000×g 4°C centrifuge30-60min, 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 分泌protein-cell分泌液 | ≥5 mL | 10000g-20000gcentrifuge30-60min, (或using0.22um滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 分泌protein-脑tissue分泌液 | ≥5 mL | 10000g-20000gcentrifuge30-60min, (或using0.22um滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 分泌protein-间质液 | ≥100 μL | 样品收集, -80°Cstore, 干冰transport |
| IP样品 | ≥50 μg | 样品洗脱时, recommend采取酸性洗脱模式, wash buffer中不recommend含have去垢剂 (SDS,NP-40,Triton-X100) ,若needusing去垢剂作for洗脱溶液, 则needadoptingSDS-PAGE对样本进行预process, 送样前, 迅速液氮中速冻, 并store于-80°C中, 干冰transport |
Answer: iTRAQ技术using四种或八种同位素标记ofreagent (iTRAQ 4-plex或iTRAQ 8-plex) , 这些reagent具have相同of分子量但不同of质量数. 样品中of肽段被标记后, 混合in一起进行质谱analyze. 由于标记reagentof质量数不同, 质谱图上会出现不同of报告离子, throughrelatively这些报告离子of强度, can定量不同样品中肽段of相对丰度, 从而推算出proteinof定量信息.
Answer: iTRAQ技术of优点including高通量, 高Sensitivity, 高Accuracyand可重复性. 该技术can同时analyze多pcs样品, 且标记过程simplerapid, 不need额外of分离步骤. 此外, iTRAQ技术还canprovide绝对定量信息, 并且对于低丰度proteinofdetect也具have较好of效果.
Answer: inusingiTRAQ技术进行protein组学research时, neednote样品of质量, 标记效率, 质谱analyzeof参数设置etc.Question. 样品应尽可能纯净, 以减少杂质对定量结果of干扰. 标记效率会影响定量Accuracy, 因此needoptimize标记条件. 此外, 质谱analyze过程中of参数设置也会影响定量结果ofAccuracyandreliable性.
Answer: iTRAQ技术with其他定量技术相比, 具have一些独特of特点. for example, iTRAQ技术can同时analyze多pcs样品, 而不need分别对每pcs样品进行独立of质谱analyze. 此外, iTRAQ技术usingofis同位素标记, 相对于其他标记技术 (such as荧光标记) 具have更高ofSensitivityandAccuracy.
Answer: iTRAQ技术广泛应用于生物学, 医学and药学etc.领域ofresearch. for example, 该技术can用于research疾病发生发展过程中ofprotein表达变化, 药物作用机制of探索as well as生物标志物of发现etc.. 此外, iTRAQ技术还canwith其他组学技术 (such asgene组学, 转录组学etc.) 相结合, for全面解析生物过程and疾病机制providehave力支持.
iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) is一种同位素标记of相对and绝对定量技术, 常用于protein组学research. 该技术using特定of化学标签标记不同样品中of肽段, 并through质谱analyzerelatively标记肽段of强度来定量protein. 以下is关于iTRAQprotein组技术detectproteinof一些常见疑问及其解A:
1, iTRAQ技术of工作原理is什么?
2, iTRAQ技术have哪些优点?
3, iTRAQ技术neednote哪些Question?
4, iTRAQ技术with其他定量技术相比have何不同?
5, iTRAQ技术in哪些领域have应用?
