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DIA定量protein组学
数据非依赖性采集( Data Independent Acquisition, DIA)定量技术, 将整pcs质谱of扫描质量范围分for若干窗口, 依times对每pcs窗口of所have离子进行碎裂, 采集全部子离子信息. utilizing业内顶尖of商业化DIAanalyze软件Spectronaut比对预先建立of谱图库即可实现定性确证and定量离子screen. DIAis一种真正全景式, 高通量of质谱技术, 大大提高了定量ofReproducibility, stable性andAccuracy,同时也可实现数据回溯analyze.
DIA具have以下特点:
(1) 无歧视地获得所have肽段of信息,不会造成低丰度protein信息of丢失,
(2) 循环时间固定,扫描点数均匀,定量accurate度高,
(3) 肽段of选择没have随机性,数据can回溯,对于复杂protein样本,especiallyis低丰度蛋 白具have更优异ofReproducibility.
with传统质谱定量“金标准”选择反应监测 / 多反应监测(SRM/MRM)相比,DIA具have以下特点:
(1) 无需提前指定目标 肽段,适用于未知proteinanalyze;
(2) 无需optimize方法,获得数据后再based on谱图库实现定性确证and定量离子screen;
(3) 通量无上限,适合大 规模protein定量analyze.
项目Experimental Procedure
非标记定量protein组学researchofmainly步骤including:protein提取, protein定量, proteinenzyme解,LC-MS/MS analyze, 数据库检索, Data AnalysisandExperimental Reportetc..
部分analyze结果图展示
iRT 肽段 (校正肽段) of洗脱时间
XvsX protein丰度比分布图
样品 PCA 得分图
XvsX relatively组火山图
XvsX 聚类analyze结果
XvsX relatively组 GO 富集统计图
KEGG 信号通路注释示例
XvsX relatively组 KEGG 富集通路统计
XvsX relatively组差异表达protein相互作用网络结果示例
| Sample Type | 送样量 | 预processandstore |
| 常规动物tissue (脑, 心, 肝, 脾, 肺, 肾, 肌肉, 皮肤etc.) | ≥30 mg | PBSwash去除残留血液and污染物, 迅速剥去脂肪and筋皮etc.结缔tissue, 冲洗干净. 用tissue剪或手术刀将tissue分离成1cm3左右of小块. 液氮速冻, storein-80°C, 干冰transport |
| 软体动物 (血吸虫, 旋毛虫etc.) | ≥200 mg | PBSwash去除来自宿主of污染. 液氮速冻, storein-80°C, 干冰transport |
| 动物软骨tissue | ≥100 mg | PBSwash, 用手术刀将软骨切成1cm3左右of小块. 液氮速冻, storein-80°C, 干冰transport |
| 动物毛发 | ≥50 mg | 用适量2%SDS, 50mM 磷酸钠 (pH7.8) 缓冲液漂洗样品, 去除污染物, 干燥, storein-80°C, 干冰transport |
| 柔软tissue (木本植物of叶, 花etc., 草本科植物, 藻类, 蕨类植物, 大型fungusetc.) | ≥50 mg | 收集样品, 液氮速冻 (such as果样品表面have泥土或明显污染物, 则液氮速冻前用PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体) , storein-80°C, 干冰transport |
| 木本科植物of树根, 树皮, 树枝etc. | ≥2 g | 收集样品, 液氮速冻 (such as果样品表面have泥土或明显污染物, 则液氮速冻前用PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体) , storein-80°C, 干冰transport |
| 果实, 种子 | ≥200 mg | 收集样品, 液氮速冻 (such as果样品表面have泥土或明显污染物, 则液氮速冻前用PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体) , storein-80°C, 干冰transport |
| 果肉 | ≥2 g | 去皮切成1cm3左右小块, 液氮速冻, store于-80°C, 干冰transport |
| 花粉 | ≥10 mg | 植物开花期收集花粉, 解剖显微镜下检查花粉, 用解剖针去除花药碎片etc.杂质, 转入EP管中, 光学显微镜下检查花粉of形态and纯度. store于-80°C, 干冰transport |
| bacteria菌类 | ≥20 mg | 3000g-5000gcentrifuge5-15min, 去上清, PBSwash沉淀三times, 液氮速冻, 菌体-80°Cstore, 干冰transport |
| fungus菌体 | ≥2 g | PBS清洗, 吸水纸吸去表面液体, 液氮速冻, store于-80°C, 干冰transport |
| 悬浮culturecell | ≥1*10^7 | 1)400g-1000gcentrifuge10minutes收获cell, 弃上清. 2)用预冷ofPBS小心wash片状沉淀物2times, 置于冰上, 去上清. 3)液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 贴壁culturecell | ≥1*10^7 | 1)弃掉culture液, 并将culture皿倒置于吸水纸上吸干culture液 2) 加入4°C预冷ofPBS, 平放轻轻摇动1minuteswashcell, 然后弃去PBS. 重复以上操作两times以洗去culture液. 3)将culture皿置于冰上. 向culture皿内加入4°C预冷ofPBS. 用干净ofcell刮棒将cell刮于culture皿of一侧 (动作要快) , 冰上斜置culture皿, 使得缓冲液流向一侧. 移液管吸取溶解产物至预冷ofcentrifuge管内. centrifuge去上清. 4)液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| Serum | ≥50 μL | 收集好of全血室温静置两hours, 3000gcentrifuge10min, 取上清, 液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 血浆 | ≥50 μL | 收集好of全血加入抗凝剂, 室温静止30minutes, 1300g-2000gcentrifuge10min, 取上清, 液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 动物乳汁或人乳汁 | ≥1mL | 收集母乳, -80°Cstore, 干冰transport. 若要去除样品中of高丰度酪protein, need超速centrifuge除去. |
| 乳脂肪球膜protein (MFGM) , 即脂质层 | ≥50 μL | 收集母乳, 4度高速centrifuge15min, 取脂质层, 用预冷of5倍体积ofPBSwash3times, 纯水wash一times, -80°Cstore, 干冰transport |
| 脑脊液, 关节液, 淋巴液, 附睾腔液 | ≥20 μL | 1000g-2000gcentrifuge5min, (或using0.22µm滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 唾液 | ≥50 μL | 禁食两hours以上, 9-12am取样, 1000g-2000gcentrifuge5min, (或using0.22um滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 泪液 | ≥100 μL | 收集样品 (可utilizingcapillary micropipette或Schirmer strip) , 8000-14000g 4度 centrifuge5min, 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 尿液 | ≥5 mL | 5000×g 4°C centrifuge30-60min, 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 分泌protein-cell分泌液 | ≥2 mL | 10000g-20000gcentrifuge30-60min, (或using0.22um滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 分泌protein-脑tissue分泌液 | ≥2 mL | 10000g-20000gcentrifuge30-60min, (或using0.22um滤膜过滤) , 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| 分泌protein-间质液 | ≥50 μL | 样品收集, -80°Cstore, 干冰transport |
| 外泌体-Serum | ≥2 mL | 收集好of全血室温静置两hours, 3000gcentrifuge10min, 取上清, 液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 外泌体-Serum | ≥2 mL | 收集好of全血加入抗凝剂, 室温静止30minutes, 1300g-2000gcentrifuge10min, 取上清, 液氮速冻, -80°Cstore, 干冰transport |
| 外泌体-尿液 | ≥30 mL | 5000×g 4°C centrifuge30-60min, 取上清, -80°Cstore, 干冰transport |
| IP样品 | ≥20 μg | 样品洗脱时, recommend采取酸性洗脱模式, wash buffer中不recommend含have去垢剂 (SDS,NP-40,Triton-X100) ,若needusing去垢剂作for洗脱溶液, 则needadoptingSDS-PAGE对样本进行预process, 送样前, 迅速液氮中速冻, 并store于-80°C中, 干冰transport |
DIA定量protein组学测试is一种protein组学技术, 用于对生物样品中ofprotein进行定量analyze. 这种技术based on质谱 (MS) and液相色谱 (LC) etc.技术, 具have高Sensitivity, 高分辨率and高通量etc.优点, 因此in生物学, 医学etc.领域得到了广泛应用. in进行DIA定量protein组学测试时, 可能会遇到一些常见ofQuestion, 下面is一些可能ofQuestion及其解A:
1, 什么isDIA定量protein组学测试?
DIA定量protein组学测试is一种based on质谱of定量protein组学技术, 它utilizing数据独立获取analyze (DIA) of方法, 对生物样品中ofprotein进行定性and定量analyze. with传统ofbased on标记of定量protein组学技术相比, DIA技术不need对样品进行标记, 因此can同时analyze多pcs样品, 并且具have更高ofSensitivityand分辨率.
2, DIA定量protein组学测试of原理is什么?
DIA定量protein组学测试of原理based on质谱and液相色谱etc.技术. in测试中, 首先将生物样品进行enzyme解, 得到肽段混合物. 然后, 将肽段混合物through液相色谱分离, 进入质谱仪进行detect. in质谱仪中, 肽段被离子化后, through电场and磁场of作用, 按照质荷比 (m/z) 进行分离anddetect. through对比不同样品中肽段of信号强度, can对protein进行定量analyze.
3, DIA定量protein组学测试have哪些优点?
DIA定量protein组学测试具have以下优点:
(1) 高通量: can同时analyze多pcs样品, 提高了analyze效率.
(2) 高Sensitivity: candetect到低丰度ofprotein.
(3) 高分辨率: can对protein进行精确of定性and定量analyze.
(4) 无需标记: 不need对样品进行标记, 避免了标记引入of实验误差.
4, DIA定量protein组学测试neednote哪些Question?
in进行DIA定量protein组学测试时, neednote以下Question:
(1) 样品制备: 样品制备isDIA定量protein组学测试of关键步骤之一. 样品of质量andprocess方法对测试结果have很大影响, 因此neednote样品ofstore, processandenzyme解etc.步骤.
(2) 数据解析: DIA定量protein组学测试产生of数据量很大, need进行复杂of数据解析. 因此, need选择合适of数据解析软件and方法, 以确保数据ofAccuracyandreliable性.
(3) 定量Accuracy: 虽然DIA定量protein组学测试具have高Sensitivityand高分辨率, 但仍然neednote定量AccuracyQuestion. for example, 样品of复杂性, 质谱仪ofstable性etc.因素都可能影响定量Accuracy. 因此, need采取一系列措施来确保定量Accuracy, for exampleusing内参protein, 进行重复实验etc..
(4) Data Analysis: DIA定量protein组学测试产生of数据need进行深入ofanalyzeand解释. 因此, need具备相关of生物信息学知识and技能, 以便对数据进行have效ofanalyzeand解读.
