ELISA方法of基本原理isenzyme分子withantibody或抗antibody分子共价结合, 此种结合不会改变antibodyof免疫学特性, 也不影响enzymeof生物学活性. 此种enzyme标记antibody可with吸附in固相载体上ofantigen或antibody发生Specificity结合. 滴加substrate溶液后, substrate可inenzyme作用下使其所含of供氢体由无色of还原型变成have色of氧化型, 出现颜色反应. 因此, 可throughsubstrateof颜色反应来判定have无相应of免疫反应, 颜色反应of深浅with标本中相应antibody或antigenof量呈正比. 此种显色反应可throughELISAdetect仪进行定量determine, 这样就将enzyme化学反应of敏感性andantigenantibody反应ofSpecificity结合起来, 使ELISA方法成for一种既specific又敏感ofDetection Method.

 such as今ELISA方法已被广泛应用于多种bacteriaandvirusetc.疾病of诊断. in动物检疫方面, ELISAin猪传染性胃肠炎,牛副结核病,牛传染性鼻气管炎,猪伪狂犬病,蓝舌病etc.of诊断中已for广泛adoptingof标准方法.

根据ELISA所用of固相载体而区分for三大类型: 一isadopting聚苯乙烯微量板for载体ofELISA, 即weusually所指ofELISA (微量板ELISA) ; 另一类is用硝酸纤维膜for载体ofELISA, 称for斑点ELISA (Dot-ELISA) ; 再一类isadopting疏水性聚脂布作for载体ofELISA, 称for布ELISA (C－ELISA) . in微量板ELISA中, 又according to其性质不同分for间接ELISA, 双antibody夹心ELISA, 双夹心ELISA, 竞争ELISA, 阻断ELISA及antibody捕捉ELISA.

间接ELISA

本法mainly用于detectantibody. 以鸭virus性肝炎(DVH) antibodyofELISAfor例, 间接ELISAof操作程序such as下.

⑴ 材料

① 包被液, wash液, 保温液, substrate液, 终止液;

② DVH包被antigen, enzyme标抗antibody, 阴性及阳性DVH参考Serum; 待检鸭Serum;

③ ELISAdetect仪, 加样器, 聚苯乙烯微量板.

⑵ 方法步骤

① 加antigen包被 → 4℃过夜, wash三times, 抛干

② 加待检Serum → 37℃ 2hours, wash三times, 抛干

③ 加enzyme标antibody → 37℃ 2hours, wash三times, 抛干

④ 加substrate液　→ 37℃ 30minutes, 加终止液

⑤ 用ELISAdetect仪determineOD值, 并计算出P/N比值.

⑶ 结果判定　已知阳性Serumwith已知阴性Serumof比值 (P/N) ≥2.1, 而且已知阳性SerumofOD值≥0.4; in上述条件成立of情况下, such as果待检Serumwith已知阴性Serumof比值 (P/N) ≥2.1, 而且待检SerumofOD值≥0.4, 则判for阳性, 否则判for阴性.

双antibody夹心

本法mainly用于detect大分子antigen. 现以detect鸡传染性法氏囊病virus (IBDV) of双夹心antibodyELISAfor例介绍本法of操作程序.

① 加antibody包被 → 4℃过夜, wash三times, 抛干

② 加待检antigen → 37℃ 30minutes, wash三times, 抛干

③ 加enzyme标antibody → 37℃ 30minutes, wash三times, 抛干

④ 加substrate液　→ 37℃ 15minutes, 加终止液

⑤ 用ELISAdetect仪determineOD值.

双夹心ELISA

此法with双antibody夹心ELISAofmainly区别in于: 它isadoptingenzyme标抗antibody检查多种大分子antigen, 它不仅不必标记每一种antibody, 还可提高试验of敏感性. 此法of基本程序for:

① 加antibody (Ab-1) 包被 → 4℃过夜, wash三times, 抛干

② 加待检antigen (Ag) → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

③ 加用非同种动物生产ofSpecificityantibody (Ab-2)→ 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

④ 加入enzyme标抗Ab-2antibody (AB-3) → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

⑤ 加substrate液 → 37℃ 20minutes, 加终止液

⑥ 用ELISAdetect仪determineOD值.

竞争ELISA

此法mainly用于determine小分子antigen及半antigen, 其原理类似于放射免疫determine. 其基本程序for:

① antibody包被 → 4℃过夜, wash三times, 抛干

② 加入待检antigen及一定量ofenzyme标antigen (control孔仅加enzyme标antigen) → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

③ 加substrate液 → 37℃ 20minutes, 加终止液

④ 用ELISAdetect仪determineOD值.

被结合ofenzyme标antigenof量由enzyme催化substrate反应产生have色产物of量来确定, such as果待检溶液中antigen越多, 被结合of标记antigenof量就越少, have色产物就减少, 这样according tohave色产物of变化就可求出未知antigenof量. 此法of优点in于rapid,Specificity高, 且可用于小分子antigen及半antigenofdetect; 其mainly不足in于每种antigen都要进行enzyme标记, 而且因forantigenof结构不同, 还需应用不同of结合方法. 此外, 试验中应用enzyme标antigenof量较多.

阻断ELISA

本法mainly用于detect型Specificityantibody. 该方法现已成for猪传染性胃肠炎 (TGE) , 猪伪狂犬病 (PR) 及猪胸膜肺炎 (AP) ofmainlyDetection Method. 下面以AP2型antibodyof阻断ELISAdetect法for例介绍其操作程序:

① 100μl AP2型工作量antigen包被 → 4℃过夜, wash三times, 抛干

② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

③ 加工作量1:4稀释被检猪Serum100μl → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

④ 加100μl工作量兔抗AP2型Serum → 37℃ 30minutes, wash三times, 抛干

⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

⑥ 加100μl OPDsubstrate液 → 37℃ 20minutes, 加终止液

⑦ 用ELISAdetect仪determineOD值.

本试验同时设标准阴, 阳性Serumcontrol, 兔抗AP2型positive control,blankcontrol.

antibody捕捉ELISA

本法mainly用于detectIgMantibody. 由于IgMantibody出现于感染早期, 所以detect出IgM, 则可作for某种疾病of早期诊断. antibody捕捉ELISAaccording to所用标记方式不同可分for标记antigen,标记antibody, 标记抗antibody捕捉ELISAetc.几种, 其中以标记antigen捕捉ELISArelativelyhave代表性, 该方法ofmainly程序for:

① 用抗u链 (抗IgM重链) antibody包被→37℃ 60minutes后置4℃过夜, wash三times, 抛干

② 加待检Serum → 37℃ 2hours, wash三times, 抛干

③ 加enzyme标antigen → 37℃ 60minutes, wash三times, 抛干

④ 加substrate液 → 37℃ 20minutes, 加终止液

⑤ 用ELISAdetect仪determineOD值.

斑点ELISA

with常规of微量板ELISArelatively, Dot-ELISA具have简便, 节省antigenetc.优点, 而且结果可长期store; 但其也have不足, mainlyisin结果判定上relatively主观, Specificity不够高etc.. 该方法ofmainly操作程序for:

⑴载体膜of预process及antigen包被　取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后, 稍加干燥进行压圈. 将阴性, 阳性antigen及被detectantigen适度稀释后加入圈中, 置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥. 每张7cm×2.3cmof膜generally可点加40－53pcs样品, 每pcs压圈可加antigen液1－20μl.

⑵ 封闭　将硝酸纤维素膜置于封闭液中, 37℃感作15－30minutes. 封闭液多adopting含have正常动物Serum, pH7.2或pH7.4ofPBS.

⑶ 加被检Serum　可直接inantigen圈上加, 也可剪下antigen圈, 置于微量板孔中, 再加入一定量适度稀释of待检Serum, 37℃反应一定时间, 用wash液洗三times, 每times1－3minutes. wash液generallyfor一定浓度ofPBS-Tween溶液.

⑷ 加enzyme标antibody, 37℃反应一定时间后, 用wash液洗三times.

⑸显色　加入新鲜配制ofsubstrate液, 37℃反应一定时间后, 去掉substrate液, 加蒸馏水wash终止反应.

⑹ 结果判定　以阳性, 阴险Serum作forcontrol, 膜片中央出现深棕红色斑点者for阳性反应, 否则for阴性反应.

布ELISA

(C－ELISA) 　C－ELISA (Cloth-ELISA) is加拿大学者Blais,B. W.etc.于1989年建立of一种新型免疫detect技术. 该方法is以疏水性聚脂布 (Hydrophobic Polyester Cloth) 即涤纶布for固相载体, 这种大孔径ofof疏水布具have吸附样品量大, 可for免疫反应provide较大of表面积, 提高反应of敏感性, 且容易wash, 不需特殊instrumentetc.优点. 其基本原理withDot-ELISA类似, 只is载体不同. 以对布氏杆菌antigenofdetectfor例, C－ELISAofmainly程序for:

⑴ 首先把抗布氏杆菌ofSerum包被 (吸附) in聚脂布上, 并经wash及封闭;

⑵ 加被检样品并于室温下感作30minutes, 然后洗5times;

⑶ 加enzyme标记of抗布氏杆菌antibody, 于室温下感作30minutes, 然后wash5times;

⑷ 加入substrate液显色;

⑸ determineOD值.

  1 待测指标ofkit (也can由公司代购) ;

        2. 待测of样品such as果不能及时detect, 请将样品store于-20℃或按照相应说明书要求进行store, 长期store于-80℃, 尽量避免反复冻融.