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线粒体gene组De novo测序is一种gene组学research方法, 用于确定线粒体DNA (mtDNA) of完整序列, especiallyisin该物种of线粒体gene组序列未知或仅have部分信息of情况下. 这种方法usually被称for“从头测序” (De novo sequencing) .
以下is线粒体gene组De novo测序ofgenerally步骤:
样本准备: 首先, need收集并准备含have线粒体DNAof样本. 这caniscell, tissue或其他生物材料.
DNA提取: 从样本中提取线粒体DNA. 这usuallyneedusing特定ofreagentand方法来分离and纯化线粒体DNA.
测序: 然后, using高通量测序技术 (such as下一代测序技术) 对线粒体DNA进行测序. 这将产生大量of序列数据, 涵盖线粒体gene组of所have区域.
Data Analysisand组装: 测序产生of数据need经过一系列ofprocessandanalyze步骤, includingQuality Control, 序列拼接and组装etc., 以得到线粒体gene组of完整序列.
注释andvalidate: most后, 对组装好of线粒体gene组进行注释, 识别并标记出gene, 调控元件etc.importantof功能区域. 同时, 可能还needthrough其他Experimental Methods来validate测序结果ofAccuracy.
线粒体gene组De novo测序对于research线粒体DNAof遗传变异, 线粒体功能, 物种进化etc.方面具haveimportant意义. for example, 它can用于识别线粒体疾病of致病突变, analyze物种间of进化关系, as well asresearch线粒体incell代谢and能量生成中of作用etc..
Experimental Procedure
analyze流程
典型结果展示
eggNOG数据库功能注释分类图
GO数据库功能注释分类图
KEGG注释通路例图
样品全gene组图谱
全gene组结构变异类型配对图
物种间of进化关系图
| Sample Type | 送样量 | 预processandstore |
| 动物tissue | ≥500 mg | 1) 无enzyme冻存管, 液氮中预冷; 2) 活体上迅速取下tissue (切成黄豆粒大小of块状) ; 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水rapid清洗tissue表面of污渍, 吸干表面液体后收集进冻存管 (管of下部分保持in液氮中) ; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store, 避免反复冻融; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| 植物表面tissue, 植物根部,茎, 叶子 | ≥2 g | 1) 无enzyme冻存管, 液氮中预冷; 2) 尽量选取新鲜, 幼嫩, 生长旺盛oftissue部位, 若for体积偏大of样本 (such as果实) , 尽量切成小块; 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水rapid清洗tissue表面of附着物, 吸干表面液体后收集进冻存管 (管of下部分保持in液氮中) ; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store, 避免反复冻融; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| 植物嫩叶片, 嫩芽 | ≥500 mg | 1) 无enzyme冻存管, 液氮中预冷; 2) 尽量选取新鲜, 幼嫩, 生长旺盛oftissue部位, 若for体积偏大of样本 (such as果实) , 尽量切成小块; 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水rapid清洗tissue表面of附着物, 吸干表面液体后收集进冻存管 (管of下部分保持in液氮中) ; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store, 避免反复冻融; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| culturecell | ≥1*10^7 | 1) 取生长状态良好cell, 确定cell数量; 2) 贴壁cell: 用1×PBS缓冲液washcell 1-2 times; 悬浮cell: centrifuge, 吸除Cell Culture液, 1×PBSwash, centrifuge弃PBS, 洗1-2times; 3) 加入适量Trizol裂解液反复吹打至裂解充分; 4) 转移至无enzymecentrifuge管中, -80 ℃store; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| 血液样品 | ≥250 μL | 1) using抗凝采血管采集全血; 2) 轻轻倒转采血管混合4-5times, 使抗凝剂with血液混匀; 3) rapid转移至单独of冻存管中, 按照250μl/管分装, 加750μl Trizol LS混匀; 4) 液氮速冻 (≥1h) 后, 转移至-80 ℃store; 5) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| fungus菌丝体 | ≥600 mg | 1) 将fungus称重 (每管200mg) , 分装多管, 请provide不少于3管of菌丝体; 2) 将称重分装后offungus置于液氮中冷冻≥1h; 3) 转移至-80 ℃store; 4) 从液氮中取出准备好of样品, 请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
| RNA样本 | 1.总量≥2 μg, 浓度≥50 ng/μL, 2. OD260/OD280in1.8-2.2之间, RNA无降解, 28/23S (真核/原核) and18/16S (真核/原核) 核糖体RNA条带very亮且清晰, Aglient 2100detect仪analyzeRNA完整性数据RIN≥8 | 1) total RNAcanstorein焦碳酸二乙酯DEPCprocess过of水中, 75%of乙醇, 异丙醇中, 具体以什么方式store请注明; 2) 无protein, gene组DNA污染, such ashave污染请去protein并进行DNase Iprocess; 3) 避免反复冻融, 应对total RNA小量分装; 4) 样品请立即放入干冰中, 并用干冰掩埋好样品. |
1.is否need纯of线粒体DNA进行测序?
不need. 实际上, 对于线粒体gene组测序, usuallycanprovide全gene组总DNA, 而不needthrough密度梯度centrifugeetc.方法获得纯of线粒体DNA. 这is因for一pcs真核生物中包含多pcs线粒体, 每一pcs线粒体中包含多条线粒体gene组DNA. 因此, 即使从全gene组总DNA中提取, 线粒体gene组DNA仍然can被have效地测序.
2.such as何从全gene组测序中获得线粒体DNA?
in全gene组测序中, 线粒体gene组DNAusuallycanthrough生物信息学analyze获得. 这including将全gene组拼接结果中高覆盖度of序列提取出来, 并with数据库进行比对analyze, 从而获得线粒体gene组DNA.
3.线粒体gene组of大小and结构such as何影响测序?
线粒体gene组usuallyis环状of, 并且大小in不同物种之间have所差异. 这种环状结构可能会对测序结果产生一些影响, for example, 对于比对软件来说, 可能会造成“半截比对”of现象, 即只能选择头或尾其中一pcs位置. 因此, inanalyze线粒体gene组数据时, need考虑这种结构特点.
4.线粒体DNAwith核geneof同源Questionsuch as何影响测序?
线粒体DNA (mtDNA) with核gene (nuMTs) 之间存in同源相似区, 部分同源区of相似程度可达100%. 这可能会in全gene组比对时造成一定程度of困扰, 因for随着读长, 测序模式of不同, 可能会造成不同程度of覆盖率缺失, 从而影响后续of突变寻找.
5.线粒体gene组测序of样品such as何准备?
对于线粒体gene组测序ofSample Preparation, usuallyneed收集并准备含have线粒体DNAof样本, such ascell或tissue. 对于植物来说, 由于线粒体/叶绿体gene组大小relatively大, 可能needadopting特定of测序方法, such asIllumina+Pacbio, 并可能needprovide富集of线粒体DNA. 常用of富集方法including超高速centrifuge富集andusing富集线粒体/叶绿体DNAkitetc..
