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utilizingQ Exactive(QE) 质谱仪对多肽andprotein进行of高分辨率修饰位点identify.protein大规模identifyanalyze (Shotgun法) 对protein进行定性analyze.将溶液内protein分子或SDS-PAGE条带of复杂混合物enzyme解成肽段混合物, through液相色谱 (HPLC) 分离, 串联质谱 (MS/MS) 测试, most后用相应of数据库进行检索匹配, 可同时identify成百上千种proteinof修饰情况.
修饰类型:
1, 磷酸化
2, 泛素化
3, 乙酰化
4, 甲基化
| shotgunidentify | 胶条 | 条带肉眼清晰可见 | 将needidentifyofSDS-PAGE条带切下, 装进EP管, 常温或冰袋寄送, 颜色very浅of条带可取多pcs重复样本放一起 | 考染protein全部接受, 银染ofprotein不得using戊二醛作for固定剂 |
| protein溶液 | protein提取正常 | 用PEG管盛放提取ofprotein液, 做好标记, 干冰寄送 | 注明液体体系成copies |
protein纯度: protein样品中若含have较多杂质, 将影响质谱仪对修饰位点ofaccurateidentify. 因此, 确保protein样品of高纯度is实验成功of关键.
proteinenzyme解: proteinenzymeof选择andenzyme解条件对肽段of产生and修饰位点of暴露haveimportant影响. for example, 胰proteinenzymeis常用ofproteinenzyme, 但不同ofenzyme解条件 (such asenzyme解时间, enzymewithsubstrateof比例etc.) 将影响肽段of生成and后续analyze.
分辨率andSensitivity: 质谱仪of分辨率andSensitivity直接影响对修饰位点ofdetect能力. 高分辨率质谱仪be able to更accurate地识别肽段and修饰基团, 而高Sensitivity则have助于detect低丰度of修饰肽段.
质谱方法选择: 不同of质谱方法 (such as一级质谱, 二级质谱etc.) 对修饰位点ofidentifyhave不同of优势and局限性. 二级质谱be able toprovide更多of结构信息, have助于accurateidentify修饰位点.
数据库比对: 质谱数据needwithprotein数据库进行比对, 以identify肽段and修饰位点. 数据库ofAccuracyand完整性对identify结果haveimportant影响.
修饰类型识别: 不同of修饰类型 (such as磷酸化, 乙酰化etc.) in质谱图上具have不同of特征. accurate识别这些特征对于确定修饰类型至关important.
假阳性with假阴性: 由于质谱数据of复杂性and不确定性, Data Analysis过程中可能出现假阳性and假阴性结果. 因此, in解释数据时neednote这些潜inQuestion.
very见修饰of富集方法: 对于某些very见或低丰度of修饰类型, 其富集方法可能不太成熟或效率较低. 这可能导致这些修饰类型in质谱图中难以被detect到.
修饰分子量偏差: 由于质谱技术of限制, 某些修饰可能导致分子量偏差过大或不确定, 从而影响修饰位点ofaccurateidentify.
避免角protein污染: in质谱identify过程中, needespeciallynote避免角protein污染. 因for角protein可能会with样品中ofprotein发生非Specificity结合, 影响Experimental Results.
using去离子水或双蒸水: in样品processand质谱analyze过程中, 应using去离子水或双蒸水, 以减少水中杂质对Experimental Resultsof影响.
1. 样品制备Question
2. 质谱instrumentand条件
3. Data Analysiswith解释
4. 技术难点
5. note事项
综上所述, 质谱identifyprotein修饰位点过程中涉及多pcs环节and因素, need综合考虑andnote. throughoptimize实验条件, 选择合适of质谱方法and数据库, accurate解释数据as well asnote技术难点andnote事项, can提高质谱identifyprotein修饰位点ofAccuracyandreliable性.
